KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

                                 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

   Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960 dan 1970. Saat ini, sudah sangat luas digunakan sebagai teknik pemisahan baik untuk analisis sampel dan pemurnian dalam variasi sampel baik dalam bidang farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan industri makanan (Settle, 1997). Hakekatnya kromatografi merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdustribusi diantara dua fase yang tidak saling bercampur yaitu fase diam dan fase gerak (Wellings, 2006). 

     Pada KCKT, fase diam berupa kolom modern dengan partikel yang sangat kecil (ditempatkan dalam kolom tertutup), sedangkan fase gerak berupa cairan yang dialirkan ke kolom menggunakan bantuan pompa dan terdapat detektor yang sensitive (McMaster, 2007). Berdasarkan mekanisme pemisahannya, diklasifikasikan berdasarkan adsorpsi, partisi, pertukaran ion dan berdasarkan ekslusi ukuran. Pada partisi dibedakan lagi menjadi kromatografi fase normal dan fase terbalik (Moffat, 2004). 

      Kromatografi adsorpsi terjadi interaksi antara solut pada permukaan fase diam, dimana fase diam berupa adsorben polar padat (silika, alumina). Kromatografi partisi berdasarkan partisi analit dalam fase gerak cair dan fase diam cair yang tidak saling bercampur dan terikat pada penyangga kolom karena adanya perbedaan kelarutan komponen sampel dalam kedua fase. Kromatografi pertukaran ion, berdasarkan pertukarn anion, atau kation pada fase diam dengan solut. Sedangkan kromatografi eksklusi ukuran, solut dipisahkan berdasarkan ukuran molekul, molekul dengan ukuran besar akan terelusi pertama dari kolom tersebut (Moffat, 2004). 

       Pada kromatografi partisi, terdapat perbedaan berdasarkan polaritas dari fase diam dan fase gerak yaitu (Harvey, 2000): 

1. Fase Normal 

   Pada kromatografi fase normal, fase diam polar sedangkan fase geraknya adalah non polar. Campuran senyawa polar akan tertahan lebih lama di dalam kolom dibandingkan dengan senyawa non polar. Sehingga senyawa non polar akan keluar dari kolom lebih cepat dibandingkan dengan senyawa polar. Fase diam dapat mengandung gugus siano, diol atau amino. 

2. Fase Terbalik 

     Kromatografi fase terbalik, yang umunya digunakan untuk analisis. Fase diam pada fase terbalik bersifat non polar, sedangkan fase gerak bersifat polar. Fase diam umumnya mengandung senyawa non polar yang mempunyai rantai karbon yang panjang, umumnya gugus n-octyl (C8) or n-octyldecyl (C18). Sehingga senyawa polar akan keluar lebih cepat dari kolom. 

    Pada dasarnya peralatan pokok yang selalu (harus) ada di dalam suatu sistem KCKT adalah sebagai berikut: 

a) Resevoir untuk fase gerak 

b) Pompa 

c) Injektor 

d) Kolom 

e) Detektor 

f) Sistem pengolah data (Recorder/ Integrator/ PC-Based Software) 

g) Termostat untuk kolom dan detektor apabila diperlukan (Kantasubrata, 2004). 

3. Solvent Resevoir 

     Sesuai dengan namanya, fungsi solvent reservoir adalah untuk menampung fase gerak yang akan dilirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Solvent resevoir biasanya terbuat dari gelas dengan volume yang bervariasi bergantung dari jumlah/ volume fase gerak yang dibutuhkan. 

4. Pompa 

     Fungsi pompa di dalam sistem KCKT adalah untuk mendorong fase gerak masuk ke dalam kolom. Tekanan pompa yang diperlukan harus cukup tinggi karena kolom KCKT berisi partikel-partikel yang sangat kecil. Pada dasarnya pompa KCKT harus memenuhi persyaratan sebagai berikut: 

a) Dapat memompa fase gerak secara konstan 

b) Mempunyai batas tekanan maksimum yang cukup tinggi (400 psi) 

c) Inert terhadap pelarut-pelarut organik (tahan terhadap fase gerak) 

d) Mempunyai noise yang rendah 

e) Cara kerja sederhana 

f) Mempunyai fluktuasi tekanan yang minimal 

5. Injektor 

    Fungsi injektor pada sistem KCKT adalah tempat untuk memasukkan cuplikan dengan bantuan syringe. Jenis injektor yang sering digunakan adalah ijektor dengan sistem loop, yaitu jenis injektor yang menggunakan katup dan loop. 

6. Kolom 

      Kolom pada sistem KCKT merupakan jantung dari sistem tersebut, karena di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan. Jadi berhasil tidaknya suatu analisis atau pemisahan komponen-komponen sangat bergantung pada kolom yang digunakan. Pemisahan dapat terjadi karena fase diam yang terdapat di dalam kolom dapat mengadakan interaksi dengan berbagai komponen dengan kekuatan berbeda satu sama lain, sehingga masing-masing komponen akan keluar dari kolom dengan waktu retensi (tR) yang juga berbeda. 

7. Detektor 

   Fungsi detektor dalam KCKT adalah untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom secara kualitatif dan kuantitatif bergantung pada kebutuhan analisis. Detektor KCKT yang baik harus mempunyai sensitifitas yang cukup tinggi atau mempunyai limit deteksi yang sangat kecil, sehingga dapat memberikan perubahan sinyal yang besar pada perubahan konsentrasi komponen cuplikan yang kecil. Detektor yang sensitif akan sangat membantu analisis kualitatif, terutama untuk trace analysis. Dua jenis detektor yang dikenal didalam KCKT adalah: 

a) Detektor Universal 

  Yaitu detektor yang yang bisa langsung digabungkan ke dalam instrument KCKT tanpa memerlukan tambahan sistem khusus. Contoh: detektor UV-Vis, detektor indeks refraksi, detektor flourescence, detektor diode array dan detektor hantaran. 

b) Detektor Khusus 

   Yaitu detektor yang memerlukan sistem khusus agar bisa digunakan sebagai detektor dalam KCKT, contoh: FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy), MS (Mass Spectrometer), dan sebagainya. c) Detektor Photo Diode Array 

   Kelebihan detektor Photo Diode Array (PDA) adalah mampu membuat spectrum senyawa dalam waktu 0,1 detik. Kelebihan ini menjawab semua kesulitan yang tak dapat dilakukan oleh detektor spektrofotometer yang lain, yaitu waktu elusi komponen melalui sel aliran detektor yang hanya 1 detik tidak cukup bagi peralatan untuk melakukan scanning untuk pembentukan spectrum. Selain itu detektor PDA mampu menampilkan kromatogram dalam bentuk tiga dimensi, yaitu hubungan antara waktu, absorpsi dan panjang gelombang (Kantasubrata, 2004). 

8. Sistem Pengolah Data (Recorder/ Integrator/ Komputer) 

    Sistem KCKT memerlukan recorder (pencatat) sebagai system pencatat yang berkualitas baik dan mampu menampilkan kromatogram dengan jelas, tepat dan cukup peka. Keuntungan KCKT (Harmita, 2006), antara lain : 

a) Waktu analisis cepat Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari 1 jam, seringkali hanya 15 menit hingga 30 menit. Untuk analisis yang mudah waktu yang diperlukan kurang dari 5 menit. 

b) Daya pisahnya baik 

c) Peka Kepekaannya sangat bergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan. 

d) Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi 

e) Kolom dapat dipakai kembali 

f) Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil 

g) Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan Tidak seperti kebanyakan detektor dalam kromatografi gas, detektor tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zat yang telah dielusi dapat dikumpulkan dengan mudah setelah melewati detektor. 

h) Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah (bergantung pada detektor yang digunakan) 

                                                            DAFTAR PUSTAKA

Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry. McGraw Hill: New York, 5778- 586,.

McMaster, M.C. 2007. HPLC A Partical User’s Guide 2th Ed. John Willey & Sons: USA,3-13.

Moffat, A. C., Osselton, M. D., dan Widdop, B. 2004. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons,[online]. http://mtnviewfarm.net/drugs-poisons-i006.html. Diakses hari Minggu, 4 Maret 2018. Pukul 13:45 WITA.

Settle, F.A. 1997. Quality Control of Herbal Medicine: Chromatographic Finger Printing and Screening for Adulterants. Nasional University of Singapore.

Wellings, D.A., 2006. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elservier, Ltd. 1-5. UK.